Przeszczepienia komórkowe w leczeniu zapaleń kostno-stawowych u psów – terapia czy efekt placebo?

Przeszczepienia komórkowe są w Polsce oferowane pacjentom weterynaryjnym od kilku lat. Wachlarz chorób, w których próbuje się wstrzykiwać komórki w celach terapeutycznych, jest zaskakująco szeroki, zwłaszcza w zestawieniu ze skąpą ilością danych na temat skuteczności takiego postępowania. Wydaje się, że hasło „terapia komórkami macierzystymi” wciąż powoduje bezkrytyczny optymizm wśród ogromnej rzeszy osób. Transplantacje komórkowe przeżywają rozkwit nie tylko w medycynie weterynaryjnej, ale także (a może przede wszystkim) w medycynie człowieka. U pacjentów ludzkich prowadzone są setki badań klinicznych, które mają na celu ocenę skuteczności przeszczepień komórkowych w różnych stanach chorobowych. Niestety, często efekty są słabsze od oczekiwanych. W wielu przypadkach ujawnia się za to bardzo pozytywne nastawienie pacjentów do tego typu terapii (lub bardziej poprawnie – procedur), co łatwo może powodować powstawanie tzw. efektu placebo. Celem niniejszego artykułu jest podsumowanie aktualnej wiedzy na temat skuteczności transplantacji komórkowych w leczeniu zapalenia kostno-stawowego (osteoarthritis – OA) u psów. Jest to jednostka chorobowa, w której najwcześniej zaczęto stosować przeszczepienia komórkowe w weterynarii małych zwierząt. W USA takiej procedurze poddaje się od kilkunastu lat tysiące zwierząt rocznie. 

Efekt placebo w weterynarii

Kwestia efektu placebo jest bardzo złożona. Generalnie jest to odczuwanie zmian w wyniku podania substancji neutralnej, co do której ma się oczekiwanie, że ma pomóc. Kiedyś uważano, że w weterynarii i pediatrii nie ma efektu placebo, ponieważ pacjent nie ma wystarczającej świadomości w zakresie oczekiwanych rezultatów terapii. Choć efekt placebo u pacjentów weterynaryjnych jest wciąż słabo opisany, to opublikowano badania, które bezspornie potwierdzają jego istnienie [1]. Wydaje się, że najważniejsze w weterynaryjnym efekcie placebo jest to, że skutki zastosowanych procedur ocenia człowiek, a nie zwierzę. Ma to szczególne znaczenie w przypadku, gdy poprawę lub pogorszenie opiera się głównie na informacjach z wywiadu (ma to miejsce przy terapii chorób związanych z przewlekłym bólem, np. OA). Opiekun zwierzęcia oczekuje poprawy i w tym względzie podlega podobnym mechanizmom jak pacjenci zażywający placebo, np. podczas prób klinicznych. Poza tym nie można zapominać, że poprawy zwykle oczekuje również lekarz prowadzący badanie, zwłaszcza gdy ma wewnętrzne przekonanie co do skuteczności testowanej terapii. Kolejną kwestią jest fakt, że kontakt z ludźmi wywiera wymierny efekt na stan psychofizyczny zwierząt towarzyszących. Uwaga i opieka, jakiej zwierzę doznaje podczas terapii, z pewnością może powodować zwiększenie komfortu, zmniejszenie stresu i tym samym mniejszą manifestację niektórych objawów (np. bólowych). A zatem efekt placebo w weterynarii może być jeszcze bardziej złożony niż w medycynie ludzkiej, ponieważ interakcje mają miejsce w trójkącie lekarz–zwierzę–opiekun, a nie jedynie pomiędzy lekarzem a pacjentem. 

Badania kliniczne w weterynarii

Badania kliniczne pozwalają na ostateczną ocenę braku szkodliwości testowanej metody leczenia i jej skuteczności. Są nieodzownym elementem rozwoju nauk medycznych. Należy jednak pamiętać, że badania kliniczne bardzo różnią się między sobą i tym samym są źródłem informacji o różnym poziomie wiarygodności. Jest oczywiste, że wnioski płynące z badania przeprowadzonego na kilku pacjentach bez zastosowania grupy kontrolnej mają inną wagę niż dane pochodzące z badania obejmującego grupę kontrolną (placebo lub alternatywna terapia), z losowym przydzieleniem do grup i podwójnym zaślepieniem (tzn. że ani pacjent, ani lekarz nie wie, w której grupie jest pacjent). Jeżeli w takim badaniu grupa poddawana testowanemu protokołowi wykaże się istotnie lepszymi wynikami niż grupy kontrolne, jest to realny dowód skuteczności nowej metody leczenia. Dodatkowym aspektem decydującym o jakości badania klinicznego jest stosowanie wymiernych technik oceny stanu pacjenta. Zastosowanie obiektywnej metody oceny jakiegoś parametru zwiększa wiarygodność danych. Przykładowo, wiadomo, że niedokrwistość można z dużym prawdopodobieństwem rozpoznać u pacjenta w badaniu klinicznym. Jednak jest również oczywiste, że podparcie obserwacji analizą obrazu czerwonokrwinkowego daje bardziej szczegółowy i pewniejszy obraz. Dodatkowo pozwala na dokładniejsze śledzenie zmian, a to jest kluczowe w testowaniu nowych terapii. Obszar badań klinicznych w medycynie weterynaryjnej rozwija się. Prowadzonych jest coraz więcej dobrze zaprojektowanych testów [2]. Jest to szczególnie ważne w przypadku przeszczepień komórkowych, które budzą sporo emocji i bardzo silne oczekiwania. 
 

Fot.1. Mezenchymalne komórki macierzyste (zrębu) – MSC. A) i B). Morfologia komórek MSC w fazie wzrostu w warunkach in vitro.Komórki od dwóch różnych dawców. C) MSC poddane różnicowaniu osteogennemu w warunkach in vitro. Na czerwono zostały wybarwione złogi wapnia wydzielane przez zróżnicowane osteocyty. D) MSC poddane różnicowaniu chondrogennemu w warunkach in vitro. Kwaśne proteoglikany macierzy pozakomórkowej zostały wybarwione błękitem alcjańskim
 

Mezenchymalne komórki macierzyste a frakcja podporowo-naczyniowa 

Mezenchymalne komórki macierzyste, nazywane również mezenchymalnymi komórkami zrębu (MSC), są obecnie najczęściej przeszczepianą populacją zarówno u ludzi, jak i u pacjentów weterynaryjnych (pomijając oczywiście przeszczepienia komórek hematopoetycznych w leczeniu chorób hematologicznych u ludzi). Populacja MSC jest intensywnie badana od ponad dekady. Poglądy na temat potencjału terapeutycznego tej populacji zmieniają się dość dynamicznie, co powoduje spore zamieszanie w przekazie informacji do szerszego grona odbiorców. Wiadomo, że są to komórki, których pierwotną niszą jest szpik kostny, w którym przede wszystkim tworzą środowisko dla prawidłowego rozwoju komórek linii hematopoetycznych. Dodatkowo są pulą komórek progenitorowych dla tkanki kostnej i chrzęstnej. Mogą być uwalniane do krwioobiegu i rekrutowane w innych tkankach, w których prawdopodobnie wspierają procesy regeneracyjne, jednak nie wiadomo, jak duże znaczenie ma ten proces w warunkach fizjologicznych. Bogatym źródłem komórek o charakterystyce MSC okazała się tkanka tłuszczowa, co spowodowało intensyfikację badań ze względu na możliwość pozyskania tej populacji w wyniku minimalnie inwazyjnego zabiegu.

 

W wielu przypadkach do przeszczepień stosowana jest frakcja naczyniowo-podporowa (SVF), a nie czysta populacja MSC. Ważne jest rozumienie różnicy pomiędzy terminem MSC a SVF. Frakcja naczyniowo-podporowa to mieszanina komórek powstająca w wyniku enzymatycznego strawienia pobranej tkanki tłuszczowej i oddzielenia erytrocytów oraz dojrzałych adipocytów. Powstała frakcja zawiera prekursory adipocytów, komórki śródbłonka i ich prekursory, fibroblasty, leukocyty, makrofagi, komórki tuczne i mezenchymalne komórki macierzyste (adipose-derived MSC – AD-MSC). Uważa się, że udział komórek AD-MSC w SFV wynosi 1–10% [3]. W tradycyjnym ujęciu frakcja SVF jest pulą wyjściową do dalszej izolacji komórek AD-MSC.
 

Fot. 2. Barwienie immunocytochemiczne komórek MSC. Wimentyna (wybarwiona na zielono) jest białkiem cytoszkieletu charakterystycznym dla komórek pochodzenia mezenchymalnego

Obecnie jednak bardzo często używa się do przeszczepień bezpośrednio tej heterogennej populacji. Zaletą takiego podejścia jest ominięcie fazy pozaustrojowego namnażania komórek, z którą związane jest ryzyko zanieczyszczenia drobnoustrojami, zmiany właściwości komórek podczas hodowli, konieczność dostępu do wysokospecjalistycznego laboratorium i wysokie koszty. Główną wadą natomiast jest niska i zmienna osobniczo zawartość komórek MSC w opisywanej frakcji. Budzi to wątpliwości co do rzeczywistego potencjału terapeutycznego tej populacji. Potencjał terapeutyczny czystej populacji MSC również jest dyskusyjny. Co ciekawe, nie ma nawet pełnego konsensusu wśród badaczy, jaki jest oczekiwany mechanizm działania tej populacji. Komórki MSC pierwotnie były postrzegane głównie jako materiał do bezpośredniej regeneracji tkanki kostnej i chrzęstnej. Dziś ten pogląd przechodzi do lamusa. Choć MSC rzeczywiście mają zdolność do różnicowania się w osteocyty i chondrocyty, to wydaje się, że zasięg tego procesu po standardowej procedurze przeszczepienia jest niewystarczający do wywołania efektu klinicznego. Obecnie dominuje pogląd, że MSC mogą oddziaływać głównie poprzez aktywność sekrecyjną. Dokładniej chodzi o stymulowanie lokalnych komórek progenitorowych (wydzielanie czynników wzrostowych i chemokin) oraz o modulowanie zachowania komórek układu immunologicznego (wydzielanie cytokin). 
 

Fot. 3. Hodowla komórek MSC powinna odbywać się w warunkach jałowych z użyciem komór z laminarym przepływem powietrza 

Wyniki badań klinicznych testujących przeszczepienia komórkowe w zapaleniach kostno-stawowych u psów

Efektem przeszukania medycznej bazy danych Pubmed było znalezienie dziewięciu publikacji opisujących wyniki przeszczepiania komórek z OA u psów (najważniejsze informacje zestawiono w tabeli 1 [4–12]). Uwzględniono dwa kryteria włączenia publikacji do zestawienia: 

• badanie wykonane na psach z naturalnie występującym OA, 
• badanie wykonane na co najmniej 5 zwierzętach. 

Taki dobór kryteriów sprawił, że pominięto wyniki badań eksperymentalnych na psach z indukowanym OA oraz opisy pojedynczych przypadków. Prace obejmują wyniki przeszczepiania hodowanych AD-MSC bądź populacji SVF. Łącznie do badań włączono 155 zwierząt. Cztery spośród dziewięciu badań uwzględniały grupę kontrolną, dwa badania były podwójnie zaślepione (łącznie 43 psy), a w czterech badaniach zastosowano zobiektywizowaną metodę oceny chodu (kulawizny) zwierząt. Tylko jedno badanie obejmowało gru...